二、染料及染色剂

1.染料
(1)甲基绿(methel green):碱性染料,商品中成分不纯,常绿中带紫。可与染细胞质的染料并用。常配成水溶液,若加1 %醋酸可使染色更好。此染料的缺点是易于在酒精中脱色,使用前可先用碘酒精处理标本2 分钟,可以减少染料的脱落。醋酸甲基绿的配制方法如下:
  甲基绿 1克
  冰醋酸 1毫升
  蒸馏水 100毫升

(2)亚甲基蓝(methylin blue):因有四个甲基,故为碱性染料。工艺上极难合成具四个甲基的纯品。商品次甲基蓝常混合其他非4个甲基的染料,如亚甲基紫(methylin violet)等。混合比不同,色调常有变化。商品上常有标记BX、B、BG及BB等(B为蓝色,G为紫色,X为混合色)不同标号,可以做为选购时参考。亚甲基蓝为核染剂之一,也是用于病理、细菌及动物组织等研究用染料,也能用于神经活体染色。
  A. 常用的配方
  亚甲基蓝 0.3克
  95 %酒精 30毫升
  亚甲基蓝溶解后,加蒸馏水100毫升
  B. 石碳酸亚甲基蓝(carbol-methyline blue) 此配方有很多变型,如:
a. 上述常用配方中再加入5 %石碳酸水溶液100毫升。
b. 上述常用配方中以0.3克亚甲基蓝溶液溶于95 %酒精30毫升中,不加蒸馏水,而加入5 %石碳酸水溶液100毫升。

(3)亮绿(light green SF yellow):为酸性染料,水中以溶解度为20 %,酒精、丁香油也可以溶解。为细胞质及纤维染色剂。常做为苏木精染色剂的复染剂。用95 %酒精配成0.2 %溶液。亮绿染色后,在日光下极易褪色,这是此色素的缺点。

(4)刚果红(Congo red):为酸性染料,色素酸(dye acid)蓝色,因含有钠盐而成红色。这种红色因游离酸存在易变为蓝色。所以利用这种性质,可以判断细胞内有无游离酸,做为指示剂使用。例如,酵母刚果红(yeast congo red),取3 克压缩新鲜酵母与50 毫克刚果红混合,加10 毫升蒸馏水,煮沸10 分钟备用。用此染色剂可以观察食物泡的变化。pH>5时,呈橙色,pH<3时呈蓝色。
  常用的染色液浓度为0.5-1.0 %水溶液,染15 分钟。

(5)中性红(neutral red):弱碱性色素,水溶液溶解度为5.64 %,酒精溶解度为2.45 %,中性点pH为7.0。稍偏碱为黄色,偏酸性为红色,强酸性为蓝色。为弱核染色剂,克染高尔基体。
  核染色后为红色,细胞质为黄色。
  中性红可以作做为活体染色剂。使用时可先配制成1 %水溶液。

(6)伊红(Eosin Y):酸性色素,构造中有4个溴(Br)原子,但商品中也混合1个和2个溴原子。溴原子多,色调浓红,若溴原子全部失去,则成为萤光染色剂。水中溶解度为44 %,酒精溶解度为2 %(26 ℃)。为苏木精的复染剂,复染时仅需数分钟或更短。
  伊红-Y 0.1-0.5克
  95 %酒精 25毫升
  蒸馏水 75毫升

(7)地衣红(orcein):属天然染料,从地衣中抽提的染色剂,主要成分为苔黑酚。弱酸性,若以碱液(如碳酸钾)溶解呈紫色。酒精溶液可以做为动物组织染色液。也可以配制成醋酸溶液,为切片或涂片或压片染色。

(8)洋红(carmine):原为天然染料,现已为人工合成染料。其主要成分为洋红酸(carmine acid)。但商品中并非全部都为洋红酸,因各制造厂工艺不同而有差异。洋红为常用的染料,如硼砂洋红(Grenacher’s borax acid),醋酸洋红(aceto carmine)等。

(9)碱性品红(basic fuchsin):碱性染料,以品红I(magenda I和rosanilin)为主体的染料,有时混合有少量的品红II(magenda II),商品中三种染料的比例因各生产厂不同有显著的差异。混合比不同,色调各异。如果有品红III(magenda III)混合,则此染料为新品红(new fuchsin)。
碱性品红是一种强核染色体染料,也可做粘液及弹力组织(elastic tissue)的染色剂。为希夫氏试剂(Schiffs reagent)的主要成分;成为孚尔根、罗逊拜客(Feulgen ,Rossenbeck . 1924)检验DNA 核反应(nucleal reaction)的无色碱性品红试液。
  碱性品红配制成的许尔咨氏液(Schulze’s solution)可以染具有鞭毛和纤毛的原生动物或多细胞动物具有鞭毛的细胞,如精子的鞭毛,原生动物的鞭毛及刺细胞的刺丝等构造。其配方如下:
  碱性品红 1 克
  95 %酒精 30 毫升
  蒸馏水 100 毫升

(10)苏木精(hematoxylin):为浅褐色粉末状晶体,从南美洋苏木树(log wood ,Haematoxylon campechianum)提出的色素。溶于水或酒精内。苏木精无染色能力,其水溶液氧化后成为海马丹(hematein)方可作为染色剂。
  海马丹水溶液呈蓝色。海马丹进一步氧化为二氧海马丹(dioxyhematein)、三氧海马丹(traoxyhematein)及四氧海马丹(tetraoxyhematein),但染色效果最高的为三氧海马丹。如果苏木精氧化过度,即全部达到四氧海马丹,染色力反而会降低,达不到理想的染色效果。所以不能认为苏木精越练越好。苏木精氧化为海马丹以后,海马丹对组织的亲和性或着色力不强,不能单独使用,常以各种金属盐类做为媒染剂,如铁明矾、铝明矾等。
  苏木精氧化或酵熟的方法很多,如配制好的苏木精放在窗台上,利用日光中的紫外光照射,使其渐渐的氧化。约经月余就可酵熟。下面介绍几种酵熟的方法:
A. 配制好的苏木精溶液,在水浴锅上加热2-3 小时,液体呈啤酒色就可以使用。
B. 配制时,加入少量水使苏木精溶解,然后再加入2-5 毫升过氧化氢,加速其氧化过程。
C. 在少量沸水中加入苏木精后,立即从火上移开,再加水至一定的浓度。
D. 苏木精先在95 %酒精中溶解,然后加入一定量蒸馏水。

2.染色剂及其配制
(1)醋酸洋红
  洋红 1克
  45 %醋酸 100毫升
  将洋红粉末倒入100 毫升45 %醋酸,边煮边搅拌,煮沸后冷却,过滤后即可使用。
  用于染细胞核、较大的染色体也可以使用。材料不需固定就可以染色。染色方法与醋酸地衣红相同。
  醋酸洋红染色时,用铁针在盖玻片周围的染色剂接触,针的铁离子就加入染色剂中,染色剂呈蓝紫色。分色后细胞核(或染色体)呈紫红色,不亚于苏木精染色。
  醋酸洋红适用于压片染色,不适于切片。
醋酸洋红、醋酸地衣红等染色剂,称做醋酸系染色剂(acetic acid),具有固定、染色双重作用,被染色的材料不需固定,立即可以染色,用于活体材料分成拿过方便。多细胞动物或单细胞动物都可以使用,前者要经过压片。

(2)醋酸地衣红
  先配制45 %冰醋酸100 毫升,加热煮沸,撤出火焰,慢慢地加入地衣红1克,用玻棒搅动,使地衣红全部溶解,放冷后过滤。再加1 %氢氧化铁(或醋酸铁)2-3滴,至染液呈红葡萄酒色即可。
  若无含铁盐类,也可不加。染色时铁针接触染液,醋酸使铁离子释放于染液中,染液渐变为暗红色,也能起媒染的作用。
醋酸地衣红为细胞核染液,能染较小的染色体,比醋酸洋红好。染色时,材料不需固定,直接用于活体材料、涂片或压片。此染液具固定、染色的联合作用。因醋酸有透明作用,染后可以直接在显微镜下观察。

(3)石炭酸品红(carbol fuchsin)
  A液:碱性品红3 克,加70 %酒精100 毫升。溶液可以长期保存。
  B液:A液10 毫升加入5 %石炭酸90 毫升。此液可保存两周。
  C液:B液55 毫升,加冰醋酸6 毫升及福尔马林6 毫升。此液可以长期保存。
  染色剂:取C液10-20 毫升加45 %冰醋酸90-80 毫升,再加入1.8 克山梨纯即成(也可不加)。须一周后成熟。此液可长期使用。
此染液对染色质及染色体有最佳的染色效果,是优良的核染色剂。对于已固定的材料或固定后又经盐酸水解的材料,皆有染色效果,也可做为固定与染色的联合染色剂。直接用于活体材料。
  如过染可用45 %醋酸适当加温褪色。由于醋酸可使材料透明,不用二甲苯透明就可以直接在显微镜下观察。欲制成永久玻片,可以经过脱水透明过程,用中性树胶封片。

(4)孚尔根核反应试剂
A.1 摩尔/升盐酸(HCl):取比重为1.19浓盐酸82.5 毫升,加1000毫升蒸馏水中即成。
B.希夫氏(Schiff’s)试剂:取碱性品红1 克,溶于200 毫升煮沸过的蒸馏水中,加温10 分钟再过滤,当温度降到50 ℃时,加20 毫升1 摩尔/升盐酸;温度降到25 ℃时,加入偏重亚硫酸钠(Na2S2O5)或偏重亚硫酸钾(K2S2O5)2 克(或3 克),盛放于棕色瓶内,置暗处24 小时,溶液由红色渐变为黄色或无色,即成为无色碱性品红(leuco-basic fuchsin),可以做为孚尔根反应试液。此液置暗处存放(或冰箱内),数月可用。
C.漂白液——亚硫酸:取10 %偏重亚硫酸钠5 毫升,加1 摩尔/升盐酸5 毫升,加蒸馏水至100 毫升即成为漂白液。

(5)水合氯醛醋酸铁矾苏木精(choral hydrate aceto iron alum haematoxylin)
  母液 苏木精 4 克
  铁明矾 1 克
  45 %冰醋酸 100 毫升
  溶解后装入瓶内,不加盖,用双层纱布将瓶口封盖,经七天后,染液酵熟。
染色液 母液(酵熟) 5 毫升
  水合氯醛 2 克
  水合氯醛(chloral hydrate)溶解后即可使用。
稀染色液:若染色液染某种材料时颜色太深,可用45 %的冰醋酸5 毫升与水合氯醛2 克比例配制稀释液,此染色液稀释5-10 倍,可得到满意的效果。
  此染液为优良的核染色液。是固定与染色可以同时进行的药剂,用于活体材料最为合适。水合氯醛与醋酸对于组织和细胞都有透明作用,能直接在显微镜下观察染色效果。欲制成永久玻片,可以用酒精脱水、二甲苯透明,中性树胶封片。

(6)安氏苏木精
A液: 硫酸铵铝 5 克
   蒸馏水 100 毫升
B液: 苏木精 2 克
   95 %酒精 100 毫升
C液: 甘油 100 毫升
   冰醋酸 10 毫升
  以上三液分别配制。将B液慢慢地滴入A液,并不断摇动,静置数天后再加入C液,置光线充足处晒1-2 个月,待呈紫色时,便可使用。

(7)改良铁矾苏木精
A液: 梅衣尔苏木精(Meyer’s hematoxyline)
  苏木精 1 克
  钾矾[KAl(SO4)2·12H2O] 50 克
  碘酸钾(KIO3) 0.2 克
  25 %盐酸水溶液 5 毫升
  蒸馏水 1000 毫升
B液: 魏格氏液(Weigert’s solution)
  硫酸亚铁铵[NH4Fe(SO4)2·12H2O] 2 克
  25 %盐酸水溶液 0.5 毫升
  蒸馏水 100 毫升
  使用前取100 份A液,加B液8 份,就可以做为染料使用。染色时间一般为5 分钟,取出后放在流水中蓝化。约3-5 分钟取出,进行脱水、透明、封片。
用此液染成细胞核为天蓝色透明。如果需要,也可以用伊红复染。此染色剂的特点是不需分化,染色速度快,可直接蓝化,也不需要媒染,使用方便省时,各种动物的组织皆可以应用。

(8)埃利希(Ehrlich)氏苏木精染液
  先将苏木精2g溶于100mL乙醇中,再加冰醋酸10mL,混合后加蒸馏水100mL和100mL甘油,然后加硫酸铝钾(约10g)至饱和,搅拌均匀,倒人瓶中。将瓶口用1层纱布包着小块棉花塞上,放在暗处通风的地方,并经常摇动促进“成熟”,直到液体颜色变为深红色为止。成熟时间约2~4周。若加0.4g碘酸钠可加快成熟。

(9)瑞氏染液(Wright’s stain)
  瑞氏粉状染料 0.1 克
  甲醇 60 毫升
  将瑞氏染料之后置于研钵中,加少量甲醇,研磨使其溶解。将溶解的染液倒入棕色玻瓶中,剩在研钵中的染料,再加入少量甲醇继续研磨促其溶解,反复进行,直到染料全部溶解。塞紧瓶口,在室温中使其酵熟。若甲醇氧化为甲醇(试纸检查),则不能配制瑞氏染料。

(10)吉姆萨(Ciemsa)氏母液
  将吉姆萨粉末1g先溶于少量甘油,在研钵内研磨30 min以上,至看不见颗粒为止,再将全部(66 mL)剩余甘油倒入,于56℃温箱内保温2h。然后再加入甲醇(66mL),搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放人冰箱可长期保存,一般刚配制的母液染色效果欠佳,保存时间越长越好。
  临用时用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。

(11)碘液
  碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300mL,先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘溶解在碘化钾溶液中,最后用水稀释至300 mL。